La storia.
L’ossido di azoto (NO), impropriamente chiamato ossido nitrico, è una specie chimica reattiva di natura radicalica centrata sull’azoto. Considerato per decenni un gas altamente inquinante – responsabile, tra l’altro, del buco dell’ozono – solo in epoca molto recente esso è stato individuato come uno dei più potenti mediatori biochimici che gli organismi viventi producono al loro interno al fine di controllare molte delle loro funzioni.
È degno di nota il fatto che a questa sostanza sia legato il premio Nobel 1998 per la Medicina/Fisiologia, attribuito al ricercatore americano Louis Ignarro “per le sue scoperte riguardanti l’ossido nitrico come molecola segnale nel sistema cardiovascolare”. Sei anni prima, la prestigiosa rivista scientifica “Science” aveva eletto l’NO come “molecola dell’anno”.

Le azioni.
E' noto da tempo che l'azione vasodilatatrice dell'acetilcolina è un'azione indiretta perchè non si osserva più se il vaso viene privato dell'endotelio.
Il responsabile diretto è il nitrossido (NO), ma per anni è stato genericamente chiamato EDRF (Endothelium Derived Relaxing Factor), poichè trattandosi di un gas è stato difficile da individuare. Esso diffonde liberamente dall'endotelio, dove viene prodotto, alla muscolatura liscia dei vasi, mediando l'azione vasodilatatrice dell'Ach.
Nei sistemi biologici, il NO agisce come un importante messaggero intra- ed inter-cellulare regolando numerosissime funzioni, in primis quella dell’endotelio vascolare. Analogamente ai nitroderivati usati da tempo nella cardiopatia ischemica, esso ha un'emivita di pochi secondi e la sua azione biologica cessa in presenza di ossiemoglobina e radicale superossido. Quest'ultimo viene inattivato dalla superossido dismutasi che pertanto potenzia l'azione del NO.
In seguito ad adeguata stimolazione (meccanica o chimica), le cellule endoteliali producono NO che in parte diffonde nel compartimento ematico, riducendo l’aggregabilità delle piastrine e l’adesività dei leucociti alle pareti dei vasi sanguigni e in parte raggiunge la sottostante muscolatura liscia vascolare inducendone il rilasciamento. I conseguenti effetti anti-aggreganti, anti-infiammatori ed anti-ipertensivi sono ritenuti di grande importanza nella prevenzione dell’aterosclerosi. I famosi nitriti esteri e la stessa nitroglicerina sublinguale, ampiamente usati come anti-anginosi decenni prima della scoperta del NO, sono, in realtà, dei donatori di questo mediatore ed è relativamente recente la messa a punto delle nitro-aspirine, derivati nitrati dell’acido acetilsalicilico in grado di rilasciare NO a livello periferico. Rimanendo nell’ambito della farmacologia cardiovascolare, il sildenafil (viagra) agisce prolungando la durata d’azione del NO a livello dei corpi cavernosi del pene, contribuendo in questo modo a migliorare la funzione erettile, variamente  compromessa nell’impotenza maschile.
Oltre all’effetto primario sull’endotelio, al NO è riconosciuto un ruolo determinante di mediatore biochimico in numerose funzioni: a livello cerebrale (controllo dell’apprendimento e della memoria), gastrointestinale (modulazione delle secrezioni e della motilità), respiratorio (modulazione del tono della muscolatura liscia bronchiale), renale (autoregolazione del flusso ematico). Gli viene anche attribuita  un’importante funzione di difesa nei confronti delle infezioni batteriche e, probabilmente, nel controllo della crescita dei tumori. A questo proposito occorre aggiungere, comunque, che condizioni di aumentato stress ossidativo (eccessiva produzione di anione superossido) comportano la conversione del NO in perossinitrito, una forma radicalica alla quale è legata la tossicità del mediatore primario.
A livello di SNC il NO viene considerato un neurotrasmettitore non convenzionale perchè essendo un gas non viene raccolto in vescicole e secreto, ma diffonde liberamente in base al gradiente di concentrazione, perciò la sua azione dipende da quanto ne viene prodotto nell'unità di tempo, dallo stato dei recettori e dall'efficienza dei sistemi di degradazione.
Esso può potenziare la citotossicità del glutammato.
Stimolando con NMDA il recettore per il glutammato delle cellule nervose contenenti NO sintasi, si ha ingresso di Ca++ che stimola la nNOS. Si ha quindi la produzione di NO che diffonde alle cellule nervose e gliali limitrofe e ne stimola la guanilato ciclasi solubile. Ciò si traduce in un aumento del rilascio di neurotrasmettitore dal neurone presinaptico. Risulta evidente l'implicazione del NO nella LTP e nei processi di apprendimento). E' interessante notare che le cellule che producono NO sono immuni ai suoi effetti.
Le azioni del NO a vari livelli in numerosi organi e sistemi (vasi, cuore, polmoni, reni, pancreas, intestino, sistema immunitario, SNC) fanno sì che il suo eccesso possa rivelarsi estremamente dannoso. Per questo la regolazione dell'attività delle NOS è molto fine ed avviene ad opera del NO stesso e di numerosi altri fattori.
Per esempio in corso di batteriemia il NO è dannoso perchè ci sono molti macrofagi attivati con la loro NOS inducibile che si impegnano in una enorme produzione di NO. Non solo, ma le endotossine e le citochine sono in grado di stimolare l'espressione della iNOS anche nell'endotelio e nelle cellule muscolari lisce. Questo è il meccanismo patogenetico alla base della drammatica vasodilatazione massiva in corso di shock settico; può determinare inoltre un aumento della risposta infiammatoria dei tessuti, danno da riperfusione e promozione dell'aterosclerosi.

Dopo che ha agito, il NO viene trasformato in una serie di derivati, quali i nitriti ed i nitrati, che si accumulano, in funzione della quantità del mediatore primario prodotto, nel sangue ed in altri fluidi extracellulari per poi essere definitivamente allontanati dall’organismo attraverso le urine.
Poiché la ridotta biodisponibilità del NO è ritenuta responsabile dell’insorgenza e/o dell’aggravamento di malattie, quali l’ipertensione arteriosa e l’aterosclerosi, numerosi studi hanno valutato la possibilità di aumentare la sintesi endogena del mediatore attraverso l’integrazione alimentare.
La strada più battuta è stata la somministrazione di L-arginina per via orale. Infatti, questo amminoacido è il diretto precursore dell’NO.

La biosintesi.
Il nitrossido viene sintetizzato dall'enzima ubiquitario NO sintasi (NOS).
Esso si localizza costitutivamente nelle cellule endoteliali (isoforma eNOS, citosolica e di membrana), piastrine, cellule del sistema nervoso (isoforma nNOS, solo citosolica), ed è inducibile (isoforma iNOS) nei macrofagi, leucociti polimorfonucleati e altre cellule immunocompetenti, essendo la sua espressione stimolata da endotossine e citochine.
Le varie isoforme differiscono per quanto riguarda la necessità di cofattori (NADPH, BH4 - tetraidrobiopterina -, FAD FMN) e la modulabilità per mezzo del complesso Ca++/calmodulina.
Le NO sintasi sono delle emoproteine che fanno parte della famiglia del citocromo P-450.
Esse catalizzano l'ossidazione di L-arginina a NO e citrullina in un processo dipendente da NADPH e ossigeno.
Sono presenti nell'organismo in tre isoforme strutturalmente correlate, malgrado le differenze nella loro dipendenza dal Ca++. Ciascuna di esse può essere suddivisa in un dominio reduttasico ed un dominio ossigenasico.
Al centro della molecola, tra i due domini, vi è un sito di legame per la calmodulina.
La porzione reduttasica di tutte le NOS ha circa il 60% di omologia con la NADPH CIT P-450 reduttasi, con cui condivide sequenze leganti NADPH, FAD e FMN.
La porzione ossigenasica, che ha omologia strutturale col CIT P-450, contiene il sito di legame per l'eme e lega il substrato L-arginina. Tra le due regioni, accanto al dominio legante la calmodulina, c'è una regione sensibile alla tripsina: la digestione mediante questa proteasi scinde infatti le NOS nei due domini ossigenasico e reduttasico.
Il complesso Ca++/calmodulina controlla l'attività della nNOS e della eNOS.
La regione di legame per la calmodulina agisce come una cerniera tra i domini reduttasico ed ossigenasico. Quando il complesso Ca++/calmodulina non è legato i due domini non sono allineati; quando il complesso Ca++/calmodulina è legato, i domini si allineano e l’enzima è attivo.
Questo modello  spiega l’attivazione della nNOS e della eNOS in seguito ad aumento dei livelli intracellulari di Ca++.
Tale modello spiega anche la non sensibilità della iNOS ai cambiamenti dei livelli di Ca++: il complesso Ca++/calmodulina è fortemente legato a questa isoforma e non se ne dissocia nemmeno a basse concentrazioni di Ca++. Nella iNOS, i domini sono quindi sempre allineati, e l’enzima è sempre attivo.
Da quanto detto sopra, le isoforme neuronale ed endoteliale della NOS sono espresse costitutivamente, ma l’attivazione dell’ enzima richiede stimolazione della via segnale Ca++/calmodulina. Invece, l’espressione della iNOS è stimolata dalle citochine o dal lipopolisaccaride (LPS) in un periodo di molte ore. Una volta che è stato indotto, questo enzima produce grosse quantità di NO e la sua attività è indipendente dai livelli intracellulari di Ca++.

La trasmissione.
Il NO si trova in uno stadio intermedio di ossidazione (radicale libero) per cui può sia ossidare che ridurre i composti chimici con cui interagisce. Esso esercita la sua funzione andando ad interagire con diversi target molecolari:

1) emoproteine ed enzimi contenenti zolfo:
 a) la stessa NOS, la cui espressione viene down-regolata
 b) la guanilato ciclasi solubile, che è il vero e proprio recettore del NO; essa viene stimolata e determina un aumento di cGMP che si traduce in una gran quantità di effetti tra cui il rilasciamento delle cellule muscolari lisce vascolari.
Il NO di contro non è in grado di interagire con la guanilato ciclasi di membrana. Il cGMP viene degradato dalla fosfodiesterasi. Un inibitore della fosfodiesterasi come il sildenafil (viagra), che agisce esclusivamente sull'isoforma endoteliale, potenzia l'azione e la durata dell'effetto vascolare del NO endogeno
 c) ossiemoglobina: l'interazione produce metaemoglobina e nitrato.
 d) la ciclossigenasi inducibile (COX-2) viene inibita.
Le vie metaboliche dei prostanoidi e del NO sono strettamente interconnesse. I prostanoidi, che comprendono le prostaglandine, la prostaciclina e il trombossano, sono tutti prodotti del metabolismo dell’acido arachidonico, e la ciclossigenasi (COX) è un fattore limitante della loro sintesi. COX e NOS hanno isoforme inducibili (COX-2 e iNOS), che rendono conto dell’ingente aumento della produzione di prostanoidi e NO presente in numerose condizioni patologiche.
La produzione microgliale di prostanoidi e NO e l’espressione di COX-2 e iNOS sono molto basse in condizioni normali, ma possono aumentare notevolmente sotto l’effetto di stimoli come quello rappresentato dal liposaccaride (LPS).
E' stato osservato che COX-2 e iNOS possono essere regolate dai prodotti terminali delle rispettive vie metaboliche, PGE2 e NO. La PGE2 esogena deprime l’espressione e l’attività enzimatica di iNOS e allo stesso tempo stimola l’espressione di COX-2 e la produzione di prostanoidi con un meccanismo di feed-back positivo che potrebbe essere paracrino o autocrino. Questi effetti della PGE2 sono mediati dall’AMP ciclico. Al contrario della PGE2, il NO, deprime l’espressione e l’attività enzimatica della COX-2.
Il significato funzionale di questo fine sistema di regolazione del rapporto tra NO e PGE2 nelle cellule microgliali potrebbe essere un ruolo neuroprotettivo della PGE2 e ad altre prostaglandine, mentre è generalmente accettato che l’eccesso di NO che può determinarsi nel cervello in svariate condizioni patologiche è in grado di causare, direttamente o indirettamente, danno o morte di neuroni e oligodendrociti. Pertanto la fine regolazione del rapporto tra le concentrazioni di queste due classi di composti potrebbe essere cruciale per indirizzare la microglia verso azioni neuroprotettive o neurotossiche.
 e) la cis-aconitasi
 f) la ribonucleotide reduttasi
 g) i complessi mitocondriali I e II ad attività ossido-reduttasica che si trovano nella parete dei mitocondri e sono molto sensibili all'azione del NO soprattutto se presente in concentrazioni superiori alla norma. Essendo in grado di liberare fattori apoptotici, i complessi mitocondriali possono essere considerati antitumorali per il loro effetto citotossico non solo a livello neuronale, ma anche di qualsiasi altra cellula. L'interazione del NO con questi complessi, soprattutto il II, causa un'alterazione nella produzione di energia; se poi avviene una solfo-nitrosilazione si ha un'alterazione strutturale e funzionale di queste proteine con dissipazione del potenziale di membrana e blocco funzionale del mitocondrio. Segue la liberazione nel citosol di fattori aptogenetici e la morte cellulare.

2) recettori NMDA: nitrosilazione con inattivazione e diminuzione dell'ingresso di Ca++. Può essere un meccanismo neuroprotettivo perchè il NO potenzia la citotossicità del glutammato
 
3) altre proteine (neurofilamenti, glutatione)

4) radicali liberi: l'interazione con l'anione superossido produce perossinitrito OONO- che causa danni irreversibili alle cellule

5) amine: le nitrosammine rilasciate dai macrofagi hanno effetto tossico sui batteri
Quindi gli effetti positivi o negativi dell'NO dipenderanno dalla concentrazione di NO, dal tipo cellulare, dall'interazione con cellule vicine, dalla presenza dei substrati (enzimi, radicali etc), dalla presenza di molecole protettive (glutatione, vitamina E, vitamina C, superossido dismutasi.

Modulazione farmacologica
Farmacologicamente è possibile modulare l'azione del NO agendo sulle NOS attraverso:
1) L-arginina: substrato della NOS; determina un aumento della produzione di NO.
Studi condotti su animali da laboratorio hanno dimostrato che l’integrazione alimentare con L-arginina, favorendo la sintesi di NO, accelera la guarigione di ulcere, migliora la disfunzione endoteliale negli iperlipemici e iperglicemici ed esercita un effetto benefico sull’ipertensione ed il metabolismo lipidico nei diabetici.
Questi favorevoli effetti dimostrano che è sperimentalmente possibile, attraverso l’aggiunta di L-arginina alla dieta, migliorare la sintesi endogena di NO e revertire gli effetti sfavorevoli dovuti ad una ridotta biodisponibilità del mediatore. D’altra parte, sembra che la carenza di arginina eserciti di per sé effetti deleteri sullo sviluppo del sistema linfoide in animali da esperimento.

Studi condotti sull’uomo hanno confermato ed esteso le potenziali indicazioni terapeutiche della L-arginina che, sia come tale – grazie all’attività immuno- ed endocrino-modulatrice – sia, soprattutto, come precursore del NO, si sta rivelando particolarmente utile nel trattamento delle varie forme cliniche della cardiopatia ischemica, quale l’angina pectoris, della claudicatio intermittens, dell’ipertensione arteriosa, dell’insufficienza cardiaca congestizia, della preeclampsia e della disfunzione erettile.
Inoltre, gli effetti dell’integrazione alimentare con L-arginina sono stati valutati anche nella terapia dell’AIDS, del diabete, della sindrome X, di alcune malattie gastrointestinali, dell’infertilità maschile e femminile, della cistite interstiziale e della demenza senile, con risultati molto interessanti.
Infine, esperimenti condotti su topi indicano che la L-arginina migliora le prestazioni muscolari in regime di esercizio aerobico attraverso un aumento della produzione di NO, e ciò conferma il già noto ruolo di questo amminoacido sulle performance atletiche.
Oggi sono disponibili numerose formulazioni orali a base di L-arginina, tra le quali andrebbero preferite quelle arricchite con antiossidanti, quali il selenio. Infatti, in talune circostanze, quali quelle legate allo stress ossidativo l’NO, pur prodotto in quantità adeguate, viene rapidamente convertito in sottoprodotti biologicamente inattivi o tossici (es. perossinitrito). Pertanto, sebbene la L-arginina possa esercitare di per sé un’azione anti-radicalica, la presenza di un antiossidante nella sua formulazione è potenzialmente in grado di aumentare la biodisponibilità del NO, sia fornendo il precursore sia neutralizzando le specie himiche reattive che tenderebbero ad inattivarlo.
Essa non dovrebbe essere assunta da soggetti in trattamento con altri farmaci che potenziano l’azione dell’NO, aumentando il rischio di tossicità da superdosaggio.

2) metilarginina, nitroarginina, iminoetilarginina: inibitori della NOS; determinano una riduzione della produzione di NO

3) nitrati organici (nitroglicerina, nitroprussiato): liberano NO. Se ne stanno studiando alcuni in grado di liberare NO in modo molto lento.